Действие игры начинается в одном из больших городов на Земле — Ванкувере. Капитан Шепард, протагонист предыдущих игр серии, находится на Земле в качестве подследственного в связи с сотрудничеством с «Цербером» и уничтожением ретранслятора. В связи с приближением Жнецов к Земле, Шепарда вызывают в Совет Альянса, где он должен представить своё видение ситуации и предложить меры по борьбе со Жнецами. В этот же момент начинается экспансия Жнецов в Солнечную систему и вторжение на Землю. Шепарду приходится срочно покинуть планету, чтобы отправиться за помощью.
Первой остановкой становится Марс, где команда Нормандии находит Лиару Т’Сони и чертежи некоего протеанского оружия (т. н. «Горна»), созданного протеанами для уничтожения Жнецов. Здесь же Шепард впервые сталкивается с «Цербером», который имеет собственное понимание способов борьбы со Жнецами.
На протяжении игры Шепарду предстоит заручиться поддержкой других рас галактики, разрешая давние конфликты между ними, помогать союзникам в сложных ситуациях, а также находить необходимые ресурсы для постройки «Горна».
Ближе к концу игры Шепард узнает расположение тайной базы «Цербера», где ему предстоит достать необходимую для завершения «Горна» информацию. Шепарду удается найти протеанские данные, из которых становится ясно, что для полноценного функционирования «Горна» необходим «Катализатор», которым является Цитадель. В то же время выясняется, что Призрак информировал Жнецов о проекте «Горн», из-за чего Цитадель была направлена на орбиту Земли, где находится большинство сил Жнецов.
В это же время в Лондоне Жнецы построили специальное устройство для транспортировки мёртвых тел людей на Цитадель. Альянс и все собранные Шепардом союзники атакуют Жнецов, чтобы получить доступ к этому устройству. Ценой огромных потерь Шепарду и адмиралу Андерсону всё-таки удается попасть на Цитадель.
Здесь они встречают Призрака, полностью подконтрольного Жнецам, и останавливают его, тем самым обеспечив успешную стыковку «Горна» с Цитаделью, что, однако, не активирует его. Шепард теряет сознание.
После пробуждения он обнаруживает некий разум, который именует себя «Катализатором». Выясняется, что именно «Катализатор» создал Жнецов и циклы уничтожения. Катализатор объясняет Шепарду, что «творение всегда будет бунтовать против своего творца, создавая хаос». По словам «Катализатора», если позволить цивилизации развиваться дальше, то в итоге она создаст искусственный интеллект, способный поработить их самих, и, таким образом, уничтожит всю органическую жизнь во Вселенной. Чтобы избежать этого были созданы циклы уничтожения, когда наиболее продвинутые расы галактики уничтожались Жнецами, после чего из них создавались новые Жнецы. Также «Катализатор» сообщает Шепарду, что данное решение больше не работает и что именно ему необходимо сделать выбор, который и определит дальнейшую судьбу галактики.
